MOLEKULARNA BIOLOGIJA PRIONOV

Marko Dolinar, Institut Jozef Stefan, Odsek za biokemijo in molekularno biologijo

Dopolnjen povzetek predavanja na Mikrobioloskih vecerih (19.11.1996)

Ta povzetek je narejen na osnovi referata "Molekularna biologija prionskih bolezni" v Diskusijski skupini za molekularno biologijo (13. marca 1996). Novosti v letu 1996 so opisane na koncu povzetka, najnovejsa spoznanja (po novembru '96) so vnesena v povzetek z modro-zeleno barvo.

Prenosljive encefalopatije so nevrodegenerativna obolenja pri zivalih in ljudeh. Povzrocitelj je prion, strukturno spremenjena molekula normalnega celicnega proteina (PrPC), in predstavlja najmanjsi znan patogen. Spekter bolezni, ki jih povzroca, zajema pri cloveku kuru, bolezen novogvinejskih kanibalov, ter dedne Creutzfeldt-Jakobovo bolezen (CJD), Gerstmann-Sträußler-Scheinkerjev sindrom (GSS), usodno dedno nespecnost (FFI), in Alperjevo bolezen, pri zivalih pa med drugim skrapiozo (ovce in koze) in spongiformno encefalopatijo pri govedih (BSE), znano pod imenom 'bolezen norih krav' (odkrili so jo 1986 pri govedih holsteinsko-frizijske pasme in ugotovili, da prioni iz goveda lahko okuzijo prasice, koze, ovce in misi, ne pa tudi hrckov). Zdravila za te bolezni ni.

Normalni celicni PrPC na doslej se ne povsem raziskan nacin posttranslacijsko preide v patogeno obliko PrPSc. Ta prehod spremlja sprememba v strukturi PrP: IR spektroskopija in analize s cirkularnim dikroizmom so pokazale, da PrPC vsebuje 42% alfa-helikalne strukture in skoraj nic beta-strukture (3%), medtem ko vsebuje PrPSc oblika 43% beta in 30% helikalne strukture. Kristalizacija nobene od oblik PrP se ni dala rezultatov, zato so modeli terciarne strukture zgolj hipoteticni. S predikcijskimi algoritmi so ugotovili 4 mozne strukturne sklope in trije od stirih sinteticnih peptidov, narejenih na osnovi teh studij, so se v raztopini zvili v beta-obliko ter se agregirali v palicke z amiloidnimi lastnostmi.

Struktura PrP

Pomemben prispevek k razumevanju narave bolezni je bila izolacija prionskega proteina, najprej iz okuzenih hrckovih mozgan, zatem pa tudi odkritje cDNA, ki zapisuje za ta protein. Protein je kodiran na kromosomalni DNA in nivo mRNA za ta protein je enak pri zdravih in obolelih osebkih. Normalni prionski protein (PrPC) je glikoprotein velikosti 33 - 35 kDa in je obcutljiv na delovanje proteinaz, medtem ko so iz obolelih mozgan izolirali obliko, ki je rezistentna na proteinaze in ima maso 27 - 30 kDa. Pri hrcku in misih je primarni translacijski produkt protein z 254 AA in zapis zanj je enak pri bolnih in zdravih zivalih. Cloveski PrP sestavlja 253 AA in vkljucuje 22 AA dolgo signalno sekvenco, ki se odcepi ob prehodu v ER. Preko GA protein preide na celicno povrsino, kamor se zasidra z glikoinozitolnim fosfolipidom (GPI), s C-ternimalnega dela molekule pa se odcepi se 23 AA. Na podrocju zanke, ki nastane za disulfidno vezjo, sta vezana oligosaharida, pripeta na Asp. V GA se na oba oligosaharida veze se sialinska kislina. Kot je znacilno za vse proteine, sidrane preko GPI, tudi PrPC ponovno vstopi v celico preko membranskih veziklov. Ob strukturni spremembi PrPC v PrPSc so opazili, da se z omejeno proteolizo ob delovanju proteinaze K z N-terminalnega dela PrPSc odcepi se okrog 67 AA, preostanek pa je za proteaze rezistenten in ga oznacujejo kot PrP 27-30.

Model replikacije prionov

Konformacijski model replikacije prionov je takle: PrPC bi se stohasticno pretvoril v delno razvit monomer (PrP*), ki je intermediat v tvorbi PrPSc. PrP* lahko preide nazaj v PrPC, lahko se razgradi, lahko pa tvori PrPSc. Pod normalnimi pogoji bi bilo PrP* malo in PrPSc bi nastajal v nesignifikantnih mnozinah. Pri infektivnih prionskih boleznih bi eksogeni prioni, ki vsebujejo PrPSc, delovali kot matrice za pretvorbo PrP* v PrPSc. Ker je PrPSc netopen, bi bila reakcija ireverzibilna. Ker bi se koncentracija PrP* zaradi pretvorbe v PrPSc zmanjsala, bi to povzrocilo povecanje nastajanja iz PrPC in na ta nacin bi ponovno lahko prislo do tvorbe PrPSc. Pri podedovanih prionskih boleznih bi mutacija v PrPC destabilizirala strukturo proteina in povecala nastajanje PrP*, s tem pa bi se povecala verjetnost nastajanja PrPSc. Narava mutacij, ki so jih doslej identificirali pri dednih prionskih boleznih, to hipotezo podpira, saj so mutacije na obmocju, kjer so napovedali helikalno strukturo ali pa na delu molekule, ki naj bi vzdrzevala stabilnost celokupne strukture. Sporadicne prionske bolezni hipoteza razlaga s slucajnim nakopicenjem PrP*; pri transgenih misih, ki prekomerno eksprimirajo normalni gen za PrP, pride do nastanka prionov in razvoja spongiformne degeneracije. Prav tako je mogoce, da pride pri spontanih oblikah bolezni do mutacij, ki imajo enak ucinek kot mutacije pri dednih oblikah bolezni.

Da gre pri nastanku PrPSc res za konformacijsko spremembo, dokazuje eksperiment (J. Tatzelt et al., EMBO J. 15, 6363-6373), v katerem so z dodatkom glicerola, DMSO ali TMAO (avtorji jih imenujejo 'kemicni caperoni') v inficiranih misjih nevroblastomskih celicah povzrocili upocasnitev prehoda PrPC v PrPSc, kar razlagajo z efektom stabilizacije alfa-helikalne strukture v PrPC. Na ze formirane PrPSc kemijski caperoni niso imeli efekta.

Medvrstna bariera

Ze dolgo je znano, da lahko prioni, izolirani iz obolelih organizmov, povzrocijo razvoj bolezni pri pripadnikih druge vrste. S poskusi na transgenih misih so ugotovili, da je infekcija najbolj ucinkovita, ce sta N-terminalni aminokislinski zaporedji PrPSc iz ene vrste in PrPC druge vrste, identicni. V nasprotenem primeru se bolezen sicer razvije, a z daljso inkubacijsko dobo. Pri tem govorijo o medvrstni barieri, vendar je zanimivo, da so naslednje pasaze infektivnega agensa vedno bolj efektne in se inkubacijska doba krajsa, kar kaze na to, da se morda aminokislinska zaporedja PrPC in PrPSc izenacijo. Pri knockout misih brez PrP (Prn-p 0/0) so opazili, da se po inokulaciji s prioni misje skrapioze bolezen ne pojavi niti po 2 letih, medtem ko so testne w-t misi poginile v 6 mesecih.

Genska struktura in ekspresija

Genetsko gledano so prionske bolezni dveh tipov: ene so dedne, druge pa spontane (frekvenca sporadicne CJD je 10-6), vendar so patolosko dedne in spontane oblike bolezni enake tistim, ki jih povzrocimo z inokulacijo PrPSc v zdrav organizem. Pri dednih oblikah bolezni so ugotovili jasno segregacijo bolezenskih znakov z mutacijami v genu Prn-p. To pomeni, da so mutacije zadosten razlog za konformacijski prehod PrPC v PrPSc in s tem razvoj bolezni. Mutacije pa same ne povzrocijo bolezni, pac pa povecajo pogostost konformacijske konverzije v PrPSc obliko. Pri cloveku je gen za PrP lociran na kratkem kraku 20. kromosoma. ORF za PrPC je v celoti znotraj enega eksona, kar pomeni, da variante PrP ne morejo nastati zaradi alternativnega splicinga RNA. Celotni gen je pri hrckih na 2 eksonih, ki sta locena z 10 kb intronom, pri misi pa na 3 eksonih. mRNA za PrP se pri odraslih zivalih eksprimira konstitutivno. Najvecja koncentracija mRNA je v mozganskih nevronih.

Dedne prionske bolezni pri cloveku

Okrog 10% primerov CJD je dednih. Mutacija na kodonu 102 PrP je genetsko povezana z GSS. Ko so uvedli mutacijo na ustreznem mestu pri transgenih misih, so opazili spontane degenerativne znake v CNS, tipicne za misjo skrapiozo, vendar pa je bila mnozina PrPSc v mozganih teh misi zelo nizka. Pri 4 juznoangleskih druzinah z dedno CJD so opazili insercijo 144 bp, ki kodira za 6 ponovitev oktapeptidne sekvence. Normalni PrP vsebuje le 5 takih ponovitev. Nekateri drugi osebki s CJD so imeli po 7 ali 9 dodatnih ponovitev, delecija enega ali insercija 4 takih ponovitev pa ne povzroci bolezni. CJD je pogosta med izraelskimi Zidi, ki izhajajo iz Libije. Sprva so menili, da je razlog v tem, da jedo na hitro prekuhane ovcje mozgane in oci, vendar pa so pri nekaterih libijskih in tunizijskih Zidih s CJD odkrili tudi mutacijo na 200. kodonu. Gre za avtosomalno dominantno okvaro, kakrsna je npr. Huntingtonova bolezen. Identificirali so se vrsto drugih mutacij, ki koincidirajo z razvojem prionskih bolezni. Po eni od teorij povzroci mutacija v PrP vecjo obcutljivost posameznika za napad virusa skrapioze.

Prehod PrPC v PrPSc in vitro

Za proteaze rezistentno obliko PrP je 1994 uspelo pripraviti in vitro, v brezcelicnem sistemu, kar utegne razjasniti mehanizem konformacijskega prehoda in spekter medvrstnih barier. Do tvorbe rezistentne oblike pride, ko (radioaktivno oznacenemu) PrPC dodajo (neoznacen) PrPSc, ki deluje kot jedro konformacijske spremembe, v dveh dneh. In vivo bi bilo pri transgenih misih potrebno vsaj 125 dni, da bi zaznali degenerativno spremembo v CNS. Do konformacijskega prehoda verjetno pride po tem, ko v prvi fazi PrPSc z delno nativno strukturo, interagira s PrPC (stabilizacija beta-strukture PrPC, tvorba H-vezi med molekulama). Med pretvorbo ni potrebna sinteza nove PrPC, niti sprememba v glikozilaciji, niti ni potrebna prisotnost glikofosfatidil-inozitolne stranske verige. Gre torej za direktno interakcijo med dvema oblikama proteinskih molekul.

Kvasni prioni

Protein z lastnostmi priona so odkrili tudi pri kvasovkah. Protein Ure2p, ki je udelezen v metabolizmu dusikovih substanc pri kvasovkah (in je bil sam znan ze pred vec kot 20 leti) lahko v redkih primerih spontano (s frekvenco 10-5) preide v neaktivno obliko (Ure2p*), ki nato povzroci inaktivacijo vseh preostalih funkcionalnih molekul Ure2p. Tak fenotip oznacujejo kot URE in 'mutacijo', ki ga je povzrocila, [URE3]. Ure2p je kodiran na kromosomskem genu. Inaktivacijske ali delecijske mutacije povzrocijo enak fenotip kot [URE3]. Selekcija mutant je lahka, saj mutante lahko porabljajo ureidosukcinat v prisotnosti NH4+ in s tem lahko kljub temu, da ne morejo sintetizirati prekurzorja uracila, rastejo v odsotnosti uracila. Podobno je z determinanto [psi], ki so jo opisali kot modifikatorja nonsense supresije pod vplivom tRNA. Odgovoren je produkt gena SUP35, dolg 685 AA in na N-terminalnem delu vsebuje ponovitve 9 AA, kar je podobno kot pri PrP. Pri Ure2p takih ponovitev sicer ni, vendar je mehanizem delovanja podoben.

Literatura:

Prusiner, S.B. (1991) Molecular biology of prion diseases, Science 252, 1515-1522
Carlson, G.A: et al. (1991) Genetics of prion infections, Trends in Genet. 7, 61-65
Bayreuther, K. & Masters, C.L. (1994) Catching the culprit prion, Nature 370, 419-420
Cohen, F.E. et al. (1994) Structural clues to prion replication, Science 264, 530-531
Weissmann C. (1994) The prion connection: Now in yeast?, ibid. 528-530
Tuite, M.F. (1994) Psi no more for yeast prions, Nature 370, 327-328
Wickner, R.B. (1994) [URE3] is an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae, Science 264, 566-569
Kocisko D.A. et al. (1994) Cell-free formation of protease-resistant prion protein, Nature 370, 471-474
Bessen, R.A. et al. (1995) Non-genetic propagation of strain-specific properties of scrapie prion protein, Nature 375, 698-700
Kocisko, D.A. et al. (1995) Species specificity in the cell-freee conversion of prion protein to protease-resistant forms: A model for the scrapie species barrier, Proc. natl. Acad. Sci. USA 92, 3923-3927

Novosti v 1996:

Opisali so novo obliko CJD, ki jo oznacujejo kot nvCJD (new variant CJD). Zanjo je znacilno, da je povprecna starost obolelih bistveno nizja kot pri obicajni CJD, da med zgodnjimi simptomi nastopajo psihicne tezave, bolezen pa traja dalj kot obicajno, prihaja do povecane tvorbe amiloidnih plakov in da ni za CJD tipicnih sprememb v EEG. Sklepajo, da je ta oblika bolezni pravzaprav posledica okuzbe z BSE, ki je presla medvrstno bariero. To delno potrjujejo zadnji rezultati molekulske analize, ki kazejo, da pri nvCJD PrP nastopa v 2 razlicno glikoziliranih oblikah (tako kot pri BSE), ne pa v treh (kot pri normalnem CJD). Z metodo, ki razlikuje glikozilacijske vzorce PrP je mogoce diagnosticirati in delno okarakterizirati vrsto PrP pri pacientih v zgodnjih stadijih bolezni.

S poskusi na transgenih knock-out misih, ki nimajo funkcionalnega gena za PrP, so ugotovili, da pri dolocenih pogojih hranjenja misi v svoji zgodnji starosti (po 70. tednu) razvijejo bolezenske znake, ki so podobni tistim, ki jih povzroci inokulacija misi s povzrociteljem skrapioze. Patoloska analiza je pokazala, da je cerebelum za tretjino manjsi kot pri normalnih misih in da je stevilo Purkinjejevih celic izrazito zmanjsano. Raziskovalci domnevajo, da je normalna funkcija PrP ta, da v dolocenem zivljenjskem obdobju onemogoca odmiranje Purkinjejevih celic. Spekulirajo tudi, da so bolezenski znaki prionskih bolezni posledica zmanjsanja koncentracije PrPC, ne pa poskodb celic zaradi agregatov PrPSc.

Dolocili so trodimenzionalno strukturo druge domene misjega PrP(121-231). S pomocjo NMR dolocena struktura se razlikuje od modelov, ki so bili doslej v veljavi kot zelo verjetni. Druga domena sama vsebuje 2 beta plosci in 3 alfa helikse - pred razresitvijo strukture so predvidevali, da PrPC oblika sploh ne vsebuje beta strukture, zato je to odkritje zelo pomembno pri razlagi iniciacije konformacijskega preklopa v PrPSc obliko.

Evropska komisija je zbrala 20 vrhunskih strokovnjakov s podrocja prionskih bolezni in jim dala za nalogo, da postavijo strategijo raziskav na tem podrocju. Med prednostne naloge znanosti so strokovnjaki, ki jih vodi prof. Weissmann z ETH v Zuerichu, vkljucili naslednje:

ugotoviti, ali se BSE lahko prenese na cloveka
razvoj zdravil, ki bi zaustavila napredovanje CJD
ugotoviti, ali navidez zdrave zivali prenasajo povzrocitelja BSE
ugotoviti, kako in med katerimi zivalmi (vrstami) se bolezen lahko prenasa
ugotoviti, ali lahko inficirano tkivo okuzi zdravo tkivo v klavnici
diagnosticanje bolezni pred nastopom prvih bolezenskih znakov
najti primerne postopke za sterilizacijo okuzenega tkiva

Zanimiva novejsa literatura in naslovi na Internetu:

R. Riek et al. (1996) NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-231). Nature 382, 180-182 (11.7.96)

J. Collinge et al. (1996) Molecular analysis of prion strain variation and the aetiology of 'new variant' CJD. Nature 383, 685-690

K.Y.Kreeger (1996) Researchers homing in on mechanisms of encelophathic diseases. The Scientist 12, 13-16 (10.6.96), http://165.123.33.33/yr1996/june/index_960610.html - Pogled na trenutne raziskave; vec prostora namenja iskanju morebitnega virusa, ki bi bil povezan s spongiformnimi encefalopatijami.

Pregled tekoce literature s stalisca veterine in zdravstvene politike (iz decemberskega Public Health News): http://www.cabi.org/whatsnew/bse/bsephn.htm

Ocena, kako BSE ne predstavlja rizika za cloveka: zdravstvena statistika, distribucija, smrtnost. http://http2.brunel.ac.uk:8080/~hssrsdn/bse/cjd.htm

S. Sakaguchi et al. (1996) Loss of cerebellar Purkinje cells in aged mice homozygous for a disrupted PrP gene. Nature 380, 528-531 (11.4.96)

Stanley Prusiner, eden od pionirjev raziskav na podrocju prionov razlaga svoj pogled na pretekla in sodobna dognanja v zvezi s prionskimi boleznimi. http://www.nmia.com/˜mdibble/prion.html

Kako caperoni (verjetno) sodelujejo pri prionskih encefalopatijah opisujejo N. Kenward et al. na: http://www.ccc.nottingham.ac.uk/˜mbzspd/tutorials/CSC.html
na kratko pa tudi Edenhofer et al. na: http://www.lmb.uni-muenchen.de/groups/winnacker/weiss/JVI_2.htm

D.C. Krakauer et al. (1996) Phylogenesis of prion protein. Nature 380, 675 (25.4.96)

Zgodovina BSE: http://www.airtime.co.uk/bse/hist.htm

Animacija konformacijske pretvorbe (temelji se na starih modelih strukture PrP): http://www.lmb.uni-muenchen.de/groups/winnacker/weiss/conversion.htm

Sinopsis predavanja dr. Heaphya virologom (29.10.96): prionske bolezni, povzrocitelj, moznosti za okuzbo z BSE, spekulacija o tem, koliko ljudi bo v UK zbolelo zaradi BSE: http://www-micro.msb.le.ac.uk/BSE/SH.html

Isti avtor je pripravil tudi sistematicen pregled znanja o prionskih boleznih: http://www-micro.msb.le.ac.uk/335/Prions.html

Zacetna stran (http://www.airtime.co.uk/bse/welcome.htm) z mnogimi povezavami, vkljucno s pregledom starejse in novejse (http://www.airtime.co.uk/bse/scij2.htm) literature (znanstvene in prispevki v dnevnem casopisju in revijah), zgodovino dogajanja v zvezi z BSE (http://www.airtime.co.uk/bse/hist.htm) statistiko o prionskih boleznih, biologijo prionskih bolezni (http://www.airtime.co.uk/bse/tse.htm), itd.

Pismo pacienta, ki je imel hemofilijo, a se je preko zdravila okuzil z virusom HIV in prioni (ali: Bolnemu cloveku se lahko vse zgodi): http://www.nmia.com/~mdibble/aletter.html

Stran s povezavami do drugih streznikov s podatki o prionih (nekatere zastarele, nekatere podvojene, a vendar tudi nekaj uporabnih): http://nmrwww.chem.rug.nl/nmr/people/AB/html/prionlinks.html

Prusiner, S.B. (1996) Molecular biology and pathogenesis of prion diseases, Trens in biochemical sciences (TIBS) 21, 482-487 (December '96): Nov pregledni clanek, napisan za studente, razlaga najpomembnejse fenomene v zvezi s prioni.

Pripombe in vprasanja posljite na naslov: Marko.Dolinar@IJS.SI.Ta verzija je bila pripravljena za WWW 22.01.97.