Diskusijska skupina za molekularno biologijo - Povzetki

Molecular Biology Discussion Group - Abstracts

Nazaj na informacijsko stran DSMB.

PROKARIOTSKI IN EUKARIOTSKI REPLIKON (enota replikacije)

Katja Drobni"c (17.1.1996)

Celotni genom organizma se mora deliti le enkrat pred celicno delitvijo. Kako je replikacija povezana s celicnim ciklom? Obstaja dvoje dejstev:
- iniciacija replikacije pripravi celico (tako pro- kot eukariotsko) za nadaljno delitev
- ko se enkrat replikacija zacne, nadaljna delitev celice ni mozna, vse dokler replikacija ni koncana.

Enoto DNA, ki se samostojno podvojuje, imenujemo REPLIKON. Ta je lahko en sam (prokariotska celica), ali pa jih je vec na celico (eukariotska celica). Studije prokariotskih,virusnih in kvasnega (Saccharomyces cerevisiae) replikona so pokazale,da je prva stopnja v replikaciji prepoznavanje specificnih sekvenc v ori oz. ars t.i. cis-faktorji, s pomocjo iniciatorskega proteina (proteinskega kompleksa) pa t.i. trans-faktorji.
Vezava iniciatorjev na ds DNA povzroci delno odvitje dupleksa poleg mesta prepoznave in nadaljne delovanje helikaze, ki se nahaja v replikacijskih vilicah, vodi do novega odvitja DNA dupleksa. Odvitje DNA sluzi kot osnova za iniciacijo sinteze DNA. Vendar slika pri zivalskih oz. sesalcjih replikonih ni tako jasna. Ve se, da so potrebni iniciatorski proteini, ki se vezejo na DNA, vendar ostaja se vedno odprto vprasanje, kam se ti proteini vezejo - na specificne ali nespecificne sekvence v genomu? Rezultati, ki jih podajajo so kontradiktorni.
Tocko, kjer se dogaja replikacija, imenujemo replikacijske vilice. Replikacija je lahko enosmerna ali dvosmerna. Kadar poteka replikacija v cirkularnem replikonu nastane struktura, ki se imenuje theta, medtem, ko nastane v mitohondrijskem in kloroplastnem replikonu D-zanka. Pri podvajanju linearnega replikona nastanejo tezave na 3'-koncu, saj podvajanje poteka vedno v smeri 5'->3'. Tako pride do vprasanja, kam naj se veze polimeraza, da bo pripela zadnjo bazo. Problem so razlicni replikoni resili razlicno:
- sprememba linearnega replikona v cirkularnega
- tvorba hairpinov na konceh
- konec ni tocno dolocen, primer eukariotski replikon
- proteini, ki se kovalento vezejo na konce DNA

Replikacija je kompleksen proces, ki obsega tri stopnje: iniciacijo (primosomi- E.coli), elongacijo (replisomi) in terminacijo (le malo se ve o proteinih, ki sodelujejo) . Najosnovnejsi proteini, ki sodelujejo so: DnaA (PriA) - priprava origina na vezavo DnaB, s tem da povzroci odvitje DNA duplexa. DnaB deluje kot helikaza, veze DnaC in je odgovorna se za forward premik DNA. DnaT je odgovorna za preprijetje proteinskih kompleksov. DnaG deluje kot primaza, odgovorna za vezavo RNA polimeraze, ki sintetizira oligonukleotidni RNA zacetnik. SSBD-proteini, ki se vezejo na ssDNA, preprecijo ponoven nastanek dupleksa.

Variabilnost replikonov
Glede nacina replikacije DNA locimo vec modelov:
vezava proteinov: podvajanje linearnih ds replikonov (virusnih Fag 29, adenovirus) s kovalentno vezavo serina v proteinu, ki ga kodira virus, s fosfatom na 5'-koncu virusne DNA. Protein prinese tudi bazo, ki komplementarno odgovarja bazi na 3' koncu. Obenem pa sluzi njen 3'-OH konec kot osnova za elongacijo s pomocjo polimeraze.
Rolling circle (kotaleci se krog): tako se podvojujeo ss fagi in neki plazmidi iz gram pozitivnih bakterij. Iniciacijski protein je Rep, ki prepozna specificne sekvence v ds originu in cepi fosfodiestersko vez v DNA. Ta razcep vkljucuje nukleofilni napad na fosfat s hidroksilno skupino, ki lahko izhaja iz aminokisline (tirozin) ali pa iz vode ob pomoci glutaminske kisline. Nastanete dva konca: 3'-konec, ki sluzi kot primer za DNA sintezo in 5' konec z vezanim Rep proteinom, ki se med replikacijo premakne in, ko je koncana povzroci nov razcep v verigi in omogoci ligacijo med novonastalim 3'-koncem in prerazporejenim 5'koncem. Replikacija je lahko nekontrolirana ali kontrolirana - zavisi od aminokislin v centru. V primeru, ko se v centru nahajata dva tirozina, poteka po vsakem krogu replikacije nova replikacija. Protein se ne odcepi iz DNA, medtem ko pride v primeru, ko se v aktivnem centru namesto enega tirozina nahaja glutaminska kislina po drugem razcepu do odcepitve proteina iz DNA.
Enosmerni theta: le ta nastane pri replikaciji ds cirkularnih plazmidov. Replikacija poteka le v eni smeri. Sodeluje lahko samo iniciatorski protein, ki ga kodira sam plazmid RepE (pAMb1-menjava polimeraz omogoca replikacijo le v eno smer), ali pa sodeluje tudi iniciatorski potein gostitelja DnaA, ki lahko skupaj koordinirata stevilo kopij na celico (P1 plazmid - repA se veze na pet 19 bp dolge ponovitve, pride do zavoja DNA okoli njega in odvitja DNA, vendar le ob prisotnosti DnaA, ki se prvi veze na dve skupini z 9 bp dolgimi ponovitvami v DNA, homologija z DNA boxi v E. coli, medtem ko deluje Rep A kot stimulator. Orientacija boxov je kriticnega pomena, da le ena stran omogoca vezavo DnaB).
Dvosmerni theta, ki mu sledi rolling circle: tako se replicirata herpes virus in l fag, ki jima je na ta nacin omogoceno, da s pomocjo rolling circla sintetizirata veliko stevilo konkatemer, ki se potem pakirajo v virusne partikle. Pride do prepoznavanja specificnih sekvenc, v primeru herpesa je iniciatorski protein UL9, ki deluje kot dimer in s svojim karboksilnim koncem prepozna specificna zaporedja v DNA in ob sodelovanje gostiteljske polimeraze alfa. Pri lambda fagu pride v zgodnji stopnji replikacije do prepoznanja ori lambda s proteinom O v obliki dimera, ki se veze na stiri ponovitve dolge 18 bp znotraj gena za protein O. Poleg tega se tu veze se protein P, ki privede DnaB in je obenem njen inhibitor. Veliko vlogo ima tudi DnaA gostitelja, ki kontrolira aktivacijo transkripcije s PR promotorja.
Dvosmerni theta: primer je bakterijski replikon E. coli. Iniciacija replikacije poteka iz enega origina oriC, ob prisotnosti 6 proteinov (DnaA, DnaB, DnaC, HU, giraza in SSBD). Pride do nastanka theta strukture, ki nastane ob vezavi do 40 monomerov DnaA proteina na stiri 9bp dolge ponovitve (DNA boxi), pri tem nastane sredica, okoli katere se ovije DNA, pri tem je potrebno, da je DNA negativno zavita. DnaA deluje na ta nacin na tri ponovitve po 13 bp, kjer se nato DNA odvije in se nanjo veze en heksamer DnaB, ki nosi vezan DnaC in nastanejo replikacijske vilice. Struktura DnaA proteina strukturno ne spominja na nobenega do sedaj izoliranega vezavnega proteina. Ugotovili so, da je za vezavo na DNA odgovornih 94 amino kislin na karboksilnem koncu in predstavljajo strukturo treh alfa-heliksov. Dvosmerno linearno: tako poteka replikacija pri eukarotski celici. Primer je kvasovka Saccaharomyces cerevisiae, pri kateri so nasli specificne sekvence, imenovane ARS (autonomously replicating sequence), na katere se veze iniciatorski proteinski kompleks 6 proteinov (ORC), ki povzroci ovitje DNA okoli njega. Model predstavlja ARS1, ki se sestoji se iz delov A, B in C. A podrocje imenovano tudi korna sekvenca, obsega 11 bp in je edini del znotraj ARS, ki je homologen med vsemi in je nujno potreben za iniciacijo replikacije, na njenem 3' koncu se nahaja T bogato podrocje in nanj se vezejo razlicni transkripcijski faktorji. B podrocje, ki je potrebno za uspesno in stabilno replikacijo, dolzine 100bp, vsebuje podrocja za vezavo transkripcijskega faktorja ABF1. C podrocje dolzine 80bp, ki se nahaja 200bp od 5' konca podrocja A. Ugotovljeno je, da izredno vlogo igra negativno superzvitje DNA za iniciacijo replikacije, stvarja pa ga tudi giraza, ki obenem relaksira pozitivno zavito DNA, ki nastaja pred replikacijskimi vilicami. Ugotovljeno je tudi, da vse ARS sekvence ne sluzijo kot origin replikacije, vkljub temu da imajo vse njene znacilnosti.
Replikacija v zivalskih celicah: Se vedno so kontradiktorni rezultati v zvezi s prisotnostjo oz. odsotnostjo specificnih sekvenc za iniciacijo replikacije. Neke skupine javljajo prisotnost specificnih mesta na kromosomu, kjer se zacne iniciacija replikacije (npr. na 3'-koncu gena za lamin se nahaja 500 bp, ki se samostojno replicirajo; v promotorju aldolaznega gena pri podganah je sekvenca 900bp, ki sluzi kot ori). Medtem pa druge skupine govorijo o razprsenosti iniciacije replikacije, ki so jih nasli znotraj netranskribiranega podrocja v genu za rodopsin ter znotraj netranskribirane regije v cloveski rDNA Vse skupine, ki delajo na replikonu iz Xenopusa prihajajo do enakih rezultatov. In sicer, da pride do prehoda iz nespecificne replikacije rDNA v zgodnji fazi embriogeneze v ne povsem nakljucno replikacijo, ki poteka znotraj netranskribiranih regij DNA, v casu ko se pricne transkripcija rDNA. Razlagi sta dve: ali se je specificnost izgubila zaradi velike prisotnosti materinih iniciatorskih proteinov, v zacetni stopnji razvoja embrija , ali pa se je replikacija omejila le na doloceno podrocje kromatina zaradi njegove strukturne spremembe, ki nastane v casu transkripcije. Mozen pa je vpliv obeh dejstev.
Replikacija pri sesalcih: ima posebno znacilnost, ki kaze na prisotnost dveh podrocij, ki naj bi bili vkljuceni v iniciacijo replikacije. Mesta, kjer se replikacija pricne in prisotnost oddaljenih sekvenc , ki so potrebne, da replikacija potece. Kaj pa so te sekvence je potrebno se dolociti: ali so to mesta za vezavo iniciatorskih proteinov, ali elementi, ki kontrolirajo transkripcijo oz. strukturo kromatina.

Regulacija iniciacije replikacije
-metilacija DNA
-vpliv kinaze odvisne od celicnega cikla
-prisotnost prereplikativnega kompleksa (razlicni cdc proteini, MCM proteini)
-fosforilacija beta podenote polimeraze alfa
-replikacija v odvisnosti od oddaljenost ori sekvenc glede na telomerne sekvence

Kontrola nepravilne replikacije
Pri bakteriji Bacillus subtilis so ugotovili, da se sinteza nepravilno replicirane DNA ustavi sele 200 kb od ori in sicer na mestu, ki spominja na njegove terminacijske sekvence. Zapora replikacije zahteva prisotnost alormona ppGpp in replikacijskega terminacijskega proteina. V sesalskih celicah so nasli protein p21, ki inhibira napacno replikacijo na dva nacina: z inhibicijo celicne kinaze in PCNA (faktorja, ki je nujen za procesiranje replikacijskih vilic).

Literatura:
Prokaryotic and eukaryotic replicons; Cell 32, 535-542, 1995 (osnova)
EMBO Journal 13, 4412-4420, 1994
EMBO Journal 12, 4547-4554, 1993
Gene 135, 125-135, 1994
J. Biol.Chem. 268, 25296-25301, 1993
Nature 357, 128-134, 1992
PNAS 90, 5399-5403,1993

Pripravljeno 18. januarja 1996.

Nazaj na informacijsko stran DSMB.

Pripombe in vprasanja vezana na vsebino posljite na naslov: Drobnic@IBMI.MF.UNI-LJ.SI, glede oblikovanja strani pa na naslov: Marko.Dolinar@IJS.SI.

HOMOLOGNA REKOMBINACIJA

Peter Dov"c (14.02.1996)

Uvod

Homologna rekombinacija je za vse organizme zelo pomemben proces, ki omogoca generiranje genetske variabilnosti, vzdrzevanje integritete genoma in pravilno razdvajanje kromosomov. Kljub bioloskemu pomenu homologne rekombinacije pa o biokemijskih detajlih molekularnih mehanizmov, ki uravnavajo izmenjavo DNA segmentov med homolognimi kromosomi se sorazmerno malo vemo. Rekombinacija je dokaj kompleksen in z biokemijskega vidika enkraten proces. V nasprotju z drugimi procesi, v katere so vkljucene nukleinske kisline (replikacija, transkripcija, translacija), katerih rezultat je biosinteza makromolekul, lahko najenostavnejsi modeli homologne rekombinacije shajajo skoraj brez ali le z minimalno sintezo DNA. To dejstvo je otezilo razvoj biokemijskih testov, ki bi lahko identificirali elemente rekombinacijske masinerije. Dodatna tezava je v tem, da je vmesne stopnje rekombinacijskega procesa tezko izolirati zaradi njihove kompleksnosti, labilnosti in sorazmerno nizke pogostnosti. V zadnjih letih je kombinacija genetskih, molekularnih in biokemijskih metod omogocila razumevanje nekaterih podrobnosti, ki tvorijo temelj izmenjavi genetskih informacij med homolognimi odseki DNA. Tako je pri prokariontih in evkariontih v proces homologne rekombinacije vkljucenih vsaj 25 proteinov. Velika vecina jih ni vkljucena v druge metabolicne procese DNA, kar dodatno otezuje identifikacijo funkcije posameznih genskih produktov v rekombinacijskem procesu. Poleg proteina RecA, ki v procesu homologne rekombinacije omogoca parjenje in izmenjavo homolognih odsekov, so za delovanje sistema potrebne se helikaze, DNaze, ATPaze, topoizomeraze, DNA polimeraze, DNA ligaze ter proteini, ki vezejo DNA in ATP. Sem lahko pristejemo se cis-element, specificno DNA zaporedje hi (5'-GCTGGTGG-3'), ki je sprva veljalo za rekombinacijski "hot spot" v bakteriofagu lambda, pomembno pa je tudi za rekombinacijo v E.coli. Pojav sinaptonemalnega kompleksa in kiazem v profazi prve mejoticne delitve je ze dolgo znana mikroskopsko vidna pojavna oblika rekombinacijskega procesa, ki podpira ugotovitev, da proces rekombinacije ni direktno povezan z replikacijo DNA.

Modeli homologne rekombinacije

Genetski modeli. Prototipni model homologne rekombinacije je predlagal Holliday pred vec kot tridesetimi leti (1964). Model vkljucuje tri bistvene lastnosti: 1. izmenjavo niti omogocata enojna preloma v obeh dvojnih vijacnicah; 2. simetricna izmenjava DNA niti povzroci nastanek heterodupleksov; 3. tako nastala zveza (Holliday-junction) se lahko razresi na dva mozna nacina, posledica cesar je nastanek dveh razlicnih tipov rekombinantnih molekul. Ta model dokaj dobro pojasnjuje bistvo homologne rekombinacije, vkljucno s fenomenom konverzije genov ob odsotnosti replikacije DNA. Kasneje je model dozivel nekaj modifikacij, ki sicer ohranjajo osnovno idejo, vendar spreminjajo nekaj bistvenih podrobnosti. Messelson-Radding (Aviemore) model vkljucuje zacetek rekombinacije z enojno DNA nitjo v povezavi z replikacijo, napadom dvojne vijacnice in degradacijo odstranjene DNA niti. Ta model obravnava nastanek asimetricnih heterodupleks regij in kopiranje genetske informacije niti-napadalke. Model popravljanja dvojnega preloma (double-strand break repair) predlaga zacetek rekombinacije na mestu dvojnega preloma molekule DNA, delno degradacijo obeh koncev, napad enojne DNA niti na homologno dvojno vijacnico in popravek preloma z vkljucitvijo genetske informacije donorske (napadene) molekule. Za sam potek homologne rekombinacije je v celici na voljo vec razlicnih poti (pathways). Katera od poti bo uporabljena je odvisno od genetskega ozadja organizma in v veliki meri od tipa molekul, ki so vkljucene v rekombinacijski proces (plazmidi, baktefriofagi, inter/intra- kromosomska rekombinacija). Tako zahteva npr. konjugacijska rekombinacija vse proteine, ki so vkljuceni v RecF pot, rekombinacija, v katero je vkljucen linearen dimeren plazmid pa le proteina RecE in RecT.

Biokemijski modeli. Kljucnega pomena za razvoj in vitro sistemov za studij homologne rekombinacije je bilo odkritje funkcije RecA proteina, ki tudi in vitro omogoca tvorbo paranemicnih povezav in za svojo funkcijo potrebuje ATP in prost konec ssDNA. Najpomembnejse fasete predstavlja studij mehanizmov napada DNA molekul (iniciacija, homologno parjenje, siritev obmocja heterodupleksa, razresitev zveze) in studij mehanizmov, ki uravnavajo prileganje (annealing) homolognih partnerjev (iniciacija, renaturacija, popravilo in ligacija).

Proteini, ki so vkljuceni v homologno rekombinacijo pri E.coli

RecA: omogoca izmenjavo DNA niti, renaturacijo DNA, je DNA-odvisna A TPaza, DNA- in ATP-odvisna koproteaza.
RecBCD (eksonukleaza V): DNA helikaza, ATP-odvisna dsDNA in ssDNA eksonukleaza, ATP-stimulirana ssDNA endonukleaza, razpoznava c zaporedje.
RecBC: DNA helikaza
RecE: (eksonukleaza VIII): dsDNA eksonukleaza, specificno delovanje v 5'-3' smeri
RecF: veze ssDNA, dsDNA in ATP
RecG: omogoca potovanje mosticka v Holliday-zvezah, DNA helikaza
RecJ: ssDNA eksonukleaza, specificno delovanje v 5'-3' smeri
RecN: funkcija ni znana, vsebuje konsenzus sekvenco za vezavo ATP
RecO: interakcija z RecR in (verjetno) z RecF proteinom
RecQ: DNA helikaza
RecR: interakcija z RecO in (verjetno) z RecF proteinom
RecT: renaturacija DNA
RuvA: veze razlicne oblike zvez (Holliday), interakcija z RuvB proteinom
RuvB: migracija mosticka v Holliday-zvezah, DNA helikaza, interakcija z RuvA proteinom
RuvC: cepitev Holliday-zvez
SbcB (eksonukleaza I): ssDNA eksonukleaza, deluje v 3'-5' smeri, deoksiribofosfodiesteraza
SbcCD: ATP-odvisna dsDNA eksonukleaza
SSB: veze ssDNA
DNA topoizomeraza I: w-protein, topoizomeraza tipa I
DNA giraza (gyrA, gyrB): DNA giraza, topoizomeraza tipa II
DNA ligaza (lig): DNA ligaza
DNA polimeraza I (polA): DNA polimeraza, 5'-3' eksonukleaza, 3'-5' eksonukleaza
Helikaza II (uvrD, uvrE, recL, mutU): DNA helikaza
Helikaza IV (helD): DNA helikaza

Literatura:

1. Kowalczykowski et al.(1994): Biochemistry of homologous recombination in E.coli. Microbiol. Rev. 401-465.
2. Cell 69: 439-456, 1992
3. Cell 69: 457-470, 1992
4. Experientia 50:223-233, 1994
5. PNAS 91:3205-3209, 1994
6. J. Biol. Chem. 262: 2066-2076, 1987

Pripravljeno 19. februarja 1996.

Nazaj na informacijsko stran DSMB.

Pripombe in vprasanja vezana na vsebino zadnjega povzetka posljite na naslov: Peter.Dovc@UNI-LJ.SI, glede oblikovanja strani pa na naslov: Marko.Dolinar@IJS.SI.

MOLEKULARNA BIOLOGIJA PRIONSKIH BOLEZNI

Marko Dolinar (13.3.1996)


/Na voljo je tudi dopolnjena verzija tega povzetka z relevantnimi WWW povezavami, pripravljena za Mikrobioloske vecere, ki jo bom poskusal (dokler bo slo) drzati v korak s casom z novimi dodatki./

Prenosljive encefalopatije so nevrodegenerativna obolenja pri zivalih in ljudeh. Povzrocitelj je prion, strukturno spremenjena molekula normalnega celicnega proteina (PrPC), in predstavlja najmanjsi znan patogen. Spekter bolezni, ki jih povzroca, zajema pri cloveku kuru, bolezen novogvinejskih kanibalov, ter dedne Creutzfeldt-Jakobovo bolezen (CJD), Gerstmann-Sträußler-Scheinekerjev sindrom (GSS) in usodno dedno nespecnost (FFI), pri zivalih pa med drugim skrapiozo (ovce in koze) in spongiformno encefalopatijo pri govedih (BSE), znano pod imenom 'bolezen norih krav' (odkrili so jo 1986 pri govedih holsteinsko-frizijske pasme in ugotovili, da prioni iz goveda lahko okuzijo prasice, koze, ovce in misi, ne pa tudi hrckov). Zdravila za te bolezni ni.

Normalni celicni PrPC na doslej se ne povsem raziskan nacin posttranslacijsko preide v patogeno obliko PrPSc. Ta prehod spremlja sprememba v strukturi PrP: IR spektroskopija in analize s cirkularnim dikroizmom so pokazale, da PrPC vsebuje 42% alfa-helikalne strukture in skoraj nic beta-strukture (3%), medtem ko vsebuje PrPSc oblika 43% beta in 30% helikalne strukture. Kristalizacija nobene od oblik PrP se ni dala rezultatov, zato so modeli terciarne strukture zgolj hipoteticni. S predikcijskimi algoritmi so ugotovili 4 mozne strukturne sklope in trije od stirih sinteticnih peptidov, narejenih na osnovi teh studij, so se v raztopini zvili v beta-obliko ter se agregirali v palicke z amiloidnimi lastnostmi.

Struktura PrP
Pomemben prispevek k razumevanju narave bolezni je bila izolacija prionskega proteina, najprej iz okuzenih hrckovih mozgan, zatem pa tudi odkritje cDNA, ki zapisuje za ta protein. Protein je kodiran na kromosomalni DNA in nivo mRNA za ta protein je enak pri zdravih in obolelih osebkih. Normalni prionski protein (PrPC) je glikoprotein velikosti 33 - 35 kDa in je obcutljiv na delovanje proteinaz, medtem ko so iz obolelih mozgan izolirali obliko, ki je rezistentna na proteinaze in ima maso 27 - 30 kDa. Pri hrcku in misih je primarni translacijski produkt protein z 254 AA in zapis zanj je enak pri bolnih in zdravih zivalih. Cloveski PrP sestavlja 253 AA in vkljucuje 22 AA dolgo signalno sekvenco, ki se odcepi ob prehodu v ER. Preko GA protein preide na celicno povrsino, kamor se zasidra z glikoinozitolnim fosfolipidom (GPI), s C-ternimalnega dela molekule pa se odcepi se 23 AA. Na podrocju zanke, ki nastane za disulfidno vezjo, sta vezana oligosaharida, pripeta na Asp. V GA se na oba oligosaharida veze se sialinska kislina. Kot je znacilno za vse proteine, sidrane preko GPI, tudi PrPC ponovno vstopi v celico preko membranskih veziklov. Ob strukturni spremembi PrPC v PrPSc so opazili, da se z omejeno proteolizo z N-terminalnega dela PrPSc odcepi se okrog 67 AA, preostanek pa je za proteaze rezistenten in ga ozncujejo kot PrP 27-30.

Model replikacije prionov
Konformacijski model replikacije prionov je takle: PrPC bi se stohasticno pretvoril v delno razvit monomer (PrP*), ki je intermediat v tvorbi PrPSc. PrP* lahko preide nazaj v PrPC, lahko se razgradi, lahko pa tvori PrPSc. Pod normalnimi pogoji bi bilo PrP* malo in PrPSc bi nastajal v nesignifikantnih mnozinah. Pri infektivnih prionskih boleznih bi eksogeni prioni, ki vsebujejo PrPSc, delovali kot matrice za pretvorbo PrP* v PrPSc. Ker je PrPSc netopen, bi bila reakcija ireverzibilna. Ker bi se koncentracija PrP* zaradi pretvorbe v PrPSc zmanjsala, bi to povzrocilo povecanje nastajanja iz PrPC in na ta nacin bi ponovno lahko prislo do tvorbe PrPSc. Pri podedovanih prionskih boleznih bi mutacija v PrPC destabilizirala strukturo proteina in povecala nastajanje PrP*, s tem pa bi se povecala verjetnost nastajanja PrPSc. Narava mutacij, ki so jih doslej identificirali pri dednih prionskih boleznih, to hipotezo podpira, saj so mutacije na obmocju, kjer so napovedali helikalno strukturo ali pa na delu molekule, ki naj bi vzdrzevala stabilnost celokupne strukture. Sporadicne prionske bolezni hipoteza razlaga s slucajnim nakopicenjem PrP*; pri transgenih misih, ki prekomerno eksprimirajo normalni gen za PrP, pride do nastanka prionov in razvoja spongiformne degeneracije. Prav tako je mogoce, da pride pri spontanih oblikah bolezni do mutacij, ki imajo enak ucinek kot mutacije pri dednih oblikah bolezni.

Medvrstna bariera
Ze dolgo je znano, da lahko prioni, izolirani iz obolelih organizmov, povzrocijo razvoj bolezni pri pripadnikih druge vrste. S poskusi na transgenih misih so ugotovili, da je infekcija najbolj ucinkovita, ce sta N-terminalni aminokislinski zaporedji PrPSc iz ene vrste in PrPC druge vrste, identicni. V nasprotenem primeru se bolezen sicer razvije, a z daljso inkubacijsko dobo. Pri tem govorijo o medvrstni barieri, vendar je zanimivo, da so naslednje pasaze infektivnega agensa vedno bolj efektne in se inkubacijska doba krajsa, kar kaze na to, da se morda aminokislinska zaporedja PrPC in PrPSc izenacijo. Pri knockout misih brez PrP (Prn-p 0/0) so opazili, da se po inokulaciji s prioni misje skrapioze bolezen ne pojavi niti po 2 letih, medtem ko so testne w-t misi poginile v 6 mesecih.

Genska struktura in ekspresija
Genetsko gledano so prionske bolezni dveh tipov: ene so dedne, druge pa spontane (frekvenca sporadicne CJD je 10-6), vendar so patolosko dedne in spontane oblike bolezni enake tistim, ki jih povzrocino z inokulacijo PrPSc v zdrav organizem. Pri dednih oblikah bolezni so ugotovili jasno segregacijo bolezenskih znakov z mutacijami v genu Prn-p. To pomeni, da so mutacije zadosten razlog za konformacijski prehod PrPC v PrPSc in s tem razvoj bolezni. Mutacije pa same ne povzrocijo bolezni, pac pa povecajo pogostost konformacijske konverzije v PrPSc obliko. Pri cloveku je gen za PrP lociran na kratkem kraku 20. kromosoma. ORF za PrPC je v celoti znotraj enega eksona, kar pomeni, da variante PrP ne morejo nastati zaradi alternativnega splicinga RNA. Celotni gen je pri hrckih na 2 eksonih, ki sta locena z 10 kb intronom, pri misi pa na 3 eksonih. mRNA za PrP se pri odraslih zivalih eksprimira konstitutivno. Najvecja koncentracija mRNA je v mozganskih nevronih.

Dedne prionske bolezni pri cloveku
Okrog 10% primerov CJD je dednih. Mutacija na kodonu 102 PrP je genetsko povezana z GSS. Ko so uvedli mutacijo na ustreznem mestu pri transgenih misih, so opazili spontane degenerativne znake v CNS, tipicne za misjo skrapiozo, vendar pa je bila mnozina PrPSc v mozganih teh misi zelo nizka.
Pri 4 juznoangleskih druzinah z dedno CJD so opazili insercijo 144 bp, ki kodira za 6 ponovitev oktapeptidne sekvence. Normalni PrP vsebuje le 5 takih ponovitev. Nekateri drugi osebki s CJD so imeli po 7 ali 9 dodatnih ponovitev, delecija enega ali insercija 4 takih ponovitev pa ne povzroci bolezni.
CJD je pogosta med izraelskimi Zidi, ki izhajajo iz Libije. Sprva so menili, da je razlog v tem, da jedo na hitro prekuhane ovcje mozgane in oci, vendar pa so pri nekaterih libijskih in tunizijskih Zidih s CJD odkrili tudi mutacijo na 200. kodonu. Gre za avtosomalno dominantno okvaro, kakrsna je npr. Huntingtonova bolezen.
Identificirali so se vrsto drugih mutacij, ki koincidirajo z razvojem prionskih bolezni. Po eni od teorij povzroci mutacija v PrP vecjo obcutljivost posameznika za napad virusa skrapioze.

Prehod PrPC v PrPSc in vitro
Za proteaze rezistentno obliko PrP je 1994 uspelo pripraviti in vitro, v brezcelicnem sistemu, kar utegne razjasniti mehanizem konformacijskega prehoda in spekter medvrstnih barier. Do tvorbe rezistentne oblike pride, ko (radioaktivno oznacenemu) PrPC dodajo (neoznacen) PrPSc, ki deluje kot jedro konformacijske spremembe, v dveh dneh. In vivo bi bilo pri transgenih misih potrebno vsaj 125 dni, da bi zaznali degenerativno spremembo v CNS. Do konformacijskega prehoda verjetno pride po tem, ko v prvi fazi PrPSc z delno nativno strukturo, interagira s PrPC (stabilizacija beta-strukture PrPC, tvorba H-vezi med molekulama). Med pretvorbo ni potrebna sinteza nove PrPC, niti sprememba v glikozilaciji, niti ni potrebna prisotnost glikofosfatidil-inozitolne stranske verige. Gre torej za direktno interakcijo med dvema oblikama proteinskih molekul.

Kvasni prioni
Protein z lastnostmi priona so odkrili tudi pri kvasovkah. Protein Ure2p, ki je udelezen v metabolizmu dusikovih substanc pri kvasovkah (in je bil sam znan ze pred vec kot 20 leti) lahko v redkih primerih spontano (s frekvenco 10-5) preide v neaktivno obliko (Ure2p*), ki nato povzroci inaktivacijo vseh preostalih funkcionalnih molekul Ure2p. Tak fenotip oznacujejo kot URE in 'mutacijo', ki ga je povzrocila, [URE3]. Ure2p je kodiran na kromosomskem genu. Inaktivacijske ali delecijske mutacije povzrocijo enak fenotip kot [URE3]. Selekcija mutant je lahka, saj mutante lahko porabljajo ureidosukcinat v prisotnosti NH4+ in s tem lahko kljub temu, da ne morejo sintetizirati prekurzorja uracila, rastejo v odsotnosti uracila. Podobno je z determinanto [psi], ki so jo opisali kot modifikatorja nonsense supresije pod vplivom tRNA. Odgovoren je produkt gena SUP35, dolg 685 AA in na N-terminalnem delu vsebuje ponovitve 9 AA, kar je podobno kot pri PrP. Pri Ure2p takih ponovitev sicer ni, vendar je mehanizem delovanja podoben.

Literatura:
Prusiner, S.B. (1991) Molecular biology of prion diseases, Science 252, 1515-1522
Carlson, G.A: et al. (1991) Genetics of prion infections, Trends in Genet. 7, 61-65
Bayreuther, K. & Masters, C.L. (1994) Catching the culprit prion, Nature 370, 419-420
Cohen, F.E. et al. (1994) Structural clues to prion replication, Science 264, 530-531
Weissmann C. (1994) The prion connection: Now in yeast?, ibid. 528-530
Tuite, M.F. (1994) Psi no more for yeast prions, Nature 370, 327-328
Wickner, R.B. (1994) [URE3] is an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae, Science 264, 566-569
Kocisko D.A. et al. (1994) Cell-free formation of protease-resistant prion protein, Nature 370, 471-474
Bessen, R.A. et al. (1995) Non-genetic propagation of strain-specific properties of scrapie prion protein, Nature 375, 698-700
Kocisko, D.A. et al. (1995) Species specificity in the cell-freee conversion of prion protein to protease-resistant forms: A model for the scrapie species barrier, Proc. natl. Acad. Sci. USA 92, 3923-3927

Povzetek je bil pripravljen za WWW 14. marca 1996. Pripombe in vprasanja vezana na vsebino zadnjega povzetka, pa tudi glede oblikovanja strani, posljite na naslov: Marko.Dolinar@IJS.SI.

Nazaj na informacijsko stran DSMB.

PRINCIPI REGULACIJE CDK KINAZ

(CDK's angl. cyclin-dependent protein kinases)

Lana Strmecki (4. 4.1996)


Od ciklinov odvisne kinaze (CDK) igrajo glavno vlogo v regulaciji poteka celicnega cikla. Delovanje samih CDK pa regulirajo stevilni izvencelicni in znotrajcelicni signali in sicer preko enega od stirih razlicnih, visoko ohranjenih biokemijskih mehanizmov.

Prehode med stanji celicnega cikla v eukariotskih celicah sprozijo CDK kinaze. Prehodi se morajo zgoditi ob pravem casu in v pravem zaporedju, zato so CDK kinaze tesno regulirane preko nekaj kompleksnih mehanizmov. V enostavnih sistemih, kot je naprimer zabji zarodek v zgodnjem stanju je aktivnost CDK kinaz odvisna od "biokemijskega oscilatorja", ki je neodvisen od dogodkov, ki jih sprozi.V somatskih ter kvasnih celicah je prislo do razvoja dodatnih regulatornih mehanizmov, ki zagotavljajo, da se aktivnost CDK kinaz med ciklom spreminja in tako vpliva na zakasnitev posameznih faz v primeru ko pogoji niso optimalni ali pa v primeru ko prejsna faza ni potekla do konca. Oscilatorji so v celicah regulirani s strani stevilnih znotrajcelicnih in izvencelicnih signalov.

Nivo CDK kinaz znotraj celic se med celicnim ciklom ne spreminja, regulacija aktivnosti je na post-translacijsem nivoju. Aktivne CDK kinaze vsebujejo vezan ciklin in so fosforilirane na visoko ohranjenem treoninu. Kinaze, ki fosforilirajo CDK, se imenujejo CAK kinaze (angl. CDK-activating kinases). Aktivni kompleks CDK-ciklin inhibirajo kinaze, ki kompleks fosforilirajo na ohranjenem treonin-tirozinskem paru ter CKI's (angl. CDK-inhibitory subunits), ki vezejo CDK kinaze. Biokemijske mehanizme aktivacije in inhibicije CDK kinaz poznamo slabo. Sele identifikacija proteinov in encimov, ki sodelujejo bo razjasnila te kompleksne mehanizme.

AKTIVACIJA PODVAJANJA DNA PRI KVASOVKI
Regulacija prehoda G1/S

Do sedaj je bilo ugotovljenih ze veliko stevilo beljakovin, ki sodelujejo pri aktivaciji podvojevanja DNA pri kvasovki. Se vedno pa je molekularna osnova regulacije faze S slabo poznana, ker vecjega dela kontrolnih poti ne poznamo. V osnovi gre pri podvojevanju za 3 osnovne korake: (1) nastanek kompleksov na specificnih zaporedjih DNA imenovanih origini, (2) prisotnost encimov in beljakovin, ki sodelujejo pri iniciaciji sinteze DNA in pri sami sintezi DNA ter (3) nastanek signala, ki omogoci, da celice preidejo v delitev, torej preko tocke imenovane START.

Imamo le zelo nejasne obrise poti, ki vodi do aktivacije faze S in se ta je dobljena z interpretacijo rezultatov posameznih delckov poti. Zacne se z vezavo ORC na element ARS. Nadaljuje se z vezavo transkripcijskih faktorjev na kompleks ARS/ORC, ki regulirajo ekspresijo genov potrebnih za podvojevanje DNA. Proteini druzine mcm verjetno delujejo, kot nekaksni licencni faktorji, ki omogocajo aktivacijsko vlogo ORC/ARS kompleksa. Na aktivacijo origina vplivajo se stevilni drugi proteini, kot so CDC6, DBF1 in CDKs, ki delujejo kasno v G1. Med procesom aktivacije origina pride do vezave polimeraze (alfa)-primaze na kompleks na originu. Pri tej vezavi verjetno sodeluje MCM3 protein. Pri podvojevanju pride do deaktivacije licencnih faktorjev (MCM2, MCM3 in CDC46) in tako origini postanejo neuporabni do naslednjega cikla.

PREHOD V MITOZO
Regulacija prehoda G2/M

Prehod celic v mitozo je povezan z aktivacijo MPF (maturation-promoting factor). MPF je sestavljen iz Ser/Thr specificne protein kinaze p34(cdc2) in ciklina B. Med G2 fazo celicnega cikla se p34(cdc2) fosforilira in prav kolicina foforiliranih Thr cdc2 kinaze igra pomembno vlogo pri regulaciji mitoze. Aktivnost cdc2 regulirata wee1 (cdc2-specificna kinaza) in fosfataza cdc25. Oba proteina sta regulirana s strani celicnega cikla. Cilj raziskav v prihodnosti je razjasnitev wee1/cdc25 regulatornega sistema in ugotavljanje povezav z ostalimi mitoznimi regulatornimi sistemi.

Pri eukariotih stevilne CDK kinaze vplivajo na iniciacijo in potek vsake od zaporednih faz celicnega cikla. Pricetek mitoze je tesno povezan z aktivacijo MPF. MPF je heterodimerna CDK kinaza sestavljena iz protein kinaze cdc2 in ciklina B. Na meji med metafazo ter anafazo mitoze pride do razgradnje ciklinske podenote, kaj vec pa o sami posttranslacijski regulaciji ciklinske podenote ni znano. Vec vemo o regulaciji cdc2 katalitske podenote. CAK fosforilira cdc2 na Thr 161 in jo tako aktivira. Wee1 prav tako fosforilira cdc2 in sicer na Thr 15 in jo tako inhibira. Eden zadnjih dogodkov, ki omogocijo prehod celic v mitozo je defosforilacija cdc2 na Thr 14 in 15, ki ga katalizira cdc25 fosfataza. Pri S. pombe prav tekmovanje med kinazo wee1 ter fosfatazo cdc25 vpliva na cas vztopa v mitozo. Oba gena tesno regulirajo stevilne "up-stream" lezece kinaze in fosfataze. Do sedaj ni razjasnjeno kako regulacija cdc2 vpliva na prehod celic v mitozo. Zanimivo je, da med stevilnimi raziskovanimi organizmi regulacija preko Thr ni tako zelo ohranjena, kot bi pricakovali. Postavlja se vprasanje v koliksni meri so mehanizmi regulacije aktivacije faze M ohranjeni med vrstami. Prehod v fazo M je verjetno reguliran s strani procesov zgodnejsih faz celicnega cikla, kot je naprimer proces podvojevanja DNA.

Poleg wee1/cdc25 sistema obstajajo se drugi sistemi, ki regulirajo prehod v mitozo. Fosforilacija cdc2 na Thr 161 je pomemben korak pri aktivaciji kinazne aktivnosti cdc2. Fosforilacijo Thr 161 opravlja CAK kinaza, ki je prav tako regulirana preko fosforilacije. Pomembna tocka regulacije bi lahko bila fosforilacija in defosforilacija CAK v odvisnosti od celicnega cikla, vendar je ugotovljeno, da je fosforilacija Thr 161 med celicnim ciklom konstitutivna.
Med G1 fazo stevilni majhni proteini imenovani CKI's vezejo CDK kinaze in jih tako inhibirajo. Do sedaj se niso nasli sorodnih proteinov, ki bi inhibirali cdc2 med G2 fazo. Pri S pombe cdc2 veze suc1 in sorodni majhni proteini, ki pa kinaze ne inhibirajo in njihova vloga ni razjasnjena.
Ugotovljeno je, da se cdc2/ciklinB kompleksi "zamrznjenih", torej ne delecih celic, ter celic, ki se normalno delijo, razlikujejo po velikosti. Kompleks pri zamrznjenih celicah je manjsi. Morda oligomerizacija cdc2 polipeptida vpliva na indukcijo mitoznih procesov. Razlicne podenote omogocajo prepoznavanje razlicnih substratov, vplivajo na intracelularno lokalizacijo ali pa vplivajo na kaksne druge lastnosti proteina. Poleg tega ne smemo pozabiti, da morda obstajajo se kaksni vzporedni mehanizmi kontrole prehoda v mitozo, ki tekmujejo s cdc2 proteinom.

Literatura
1. Nature:374, page 131 (9 March 1995).
2. Cell:61, page 743 (June 1990).
3. Cell:79, page 181 (October 1994).
4.TIBS:19, page 143 (April 1994).
5.Science:246, page 629 (November 1989).
6.TIBS:20, page 70 (Feb 1995).
7.Trends in Cell Biol:4, page 202 (June 1994).
8.Nature:374, page 131 (March 1995).
9.Cell:66, page 1071 (Sept 1991).

Povzetek je bil pripravljen za WWW 5. aprila 1996. Pripombe in vprasanja glede vsebine zadnjega povzetka posljite Lani (Strmecki@ibmi.mf.uni-lj.si), glede oblikovanja strani pa na naslov: Marko.Dolinar@IJS.SI.

Nazaj na informacijsko stran DSMB.

MOLEKULARNA OSNOVA SEPTICNEGA SOKA

Roman Jerala (27.6.1996)

Lipopolisaharidi (LPS) so glavna sestavina zunanje membrane Gram-negativnih bakterij. Sestavljeni so iz lipidnega dela imenovanega lipid A, sladkornega preostanka KDO in O-specificnega antigena, ki se razlikuje med vrstami bakterij in predstavlja najpomembnejso antigensko komponento. Prav lipopolisaharidi oz. lipid A so povzrocitelji septicnega soka. LPS predstavlja za celice organizma mocan signal, ki sprozi izlocanje citokinov (TNFa, IL-1beta, IL-6, IL-8) in drugih npr. adhezijskih molekul. Ti mediatorji nato povzrocijo simptome septicnega soka, ki lahko vodijo v odpoved organov, ARDS (adult respiratory distress syndrome) in pogosto v smrt. Samo v ZDA umre letno zaradi septicnega soka pr. 180.000 ljudi.

LPS se ob vecjih koncentracijah lahko direktno vgradi v membrano, lahko pa se veze na razlicne receptorje. Pri 1000x manjsih koncentracijah, ki ze lahko povzrocijo simptome septicnega soka pa je odziv celic odvisen od receptorja CD14. Ta receptor se nahaja v membrani makrofagov in nevtrofilcev vsidran preko fosfatidilinozitolnega preostanka. V serumu obstaja tudi topna oblika CD14, ki je odgovorna za delovanje na celice, ki nimajo membranskega LPS (epiteijske, endodelijske celice). Za popoln odziv je potrebna se prisotnost proteina LBP (lipopolysaccharide binding protein) v serumu. LBP deluje kot katalizator, ki se veze na micele LPS in prenese monomer LPSa na CD14. Po vezavi LPS na CD14 naslednja stopnja se ni pojasnjena. Veliko truda je trenutno usmerjenega v iskanje domnevnega membranskega receptorja za LPS in CD14, ki bi prenesel signal na citoplazemsko stran membrane. V citoplazmi se najbrz aktivira od ceramida odvisna protein kinaza, ki sprozi kaskado fosforilacij, ki vodijo do aktivacije NFkB preko inaktivacije njegovega inhibitorja. NFkB se nato v jedru veze na specificne regulacijske sekvence in sprozi transkripcijo stevilnih molekul, ki sodelujejo v akutnem odzivu, predvsem TNFa in IL-1b.

Trenutno ne obstaja ucinkovita terapija septicnega soka. V fazi preizkusanj so razlicna protitelesa (proti LPS, TNFaOmega). Druga potencialna zdravila so analogi LPS, ki delujejo kot antagonisti, peptidi, ki lahko vezejo in nevtralizirajo LPS (npr. antibiotik polymixin B), rekombinantni CD14, lipoprotein.

Ref: Ulevitch and Tobias (1994) Current Opinion in Immunology 6: 125-130.

Povzetek je bil pripravljen za WWW 24. junija 1996. Pripombe in vprasanja glede vsebine zadnjega povzetka posljite Romanu (Roman.Jerala@ijs.si), glede oblikovanja strani pa na naslov: Marko.Dolinar@IJS.SI.

Nazaj na informacijsko stran DSMB.

GENSKA TERAPIJA "up to date"
(Lana Strmecki, 12.11.1996)

Pristopi:

V idealnem primeru bi genska terapija bila nekaksna "transplantacija" kjer bi mutiran gen nadomestili z normalnim. Jasno, da so tehnicne tezave ogromne. Gen je potrebno v celice vkljuciti tako, da je zagotovljena dovolj stabilna ekspresija gena. Nastali proteinski produkt naj bi kompenziral pomankanje zaradi okvare originalnega gena. Ta pristop je najbolj primeren za zdravljenje recesivnih monogenskih bolezni in ni primeren za dominantno dedovane okvare, kjer spremenjeni protein spremeni delovanje celice. Ta pristop je torej neprimeren za vse tiste bolezni, kjer je potrebno odstraniti vpliv spremenjenega proteina (npr. rakasta obolenja, infekcijske bolezni).

Tezave pri izbiri pogojev za gensko terapijo:

Pogoje za uspesno "gensko terapijo" je zelo tezko izpolniti na vseh nivojih. 1. Najprej je potebno izolirati zeljeni gen skupaj z vsemi njegovimi regulatornimi sekvencami. 2. Uporaba uspesnega mehanizma za vkljucevanje gena v tarcne celice. 3. Zagotoviti je potrebno dovolj veliko stevilo celic za transdukcijo. 4. Uspesno vstavljen gen naj bi proizvajal dovolj veliko kolicino proteina cim dalj casa. 5. Zagotoviti primeren in uspesen prenos transduciranih celic v bolnika. 6. Ekspresija in-vivo ne korelira vedno z ekspresijo in-vitro. 7. Nastajajoci protein ne sme imeti slabih stranskih ucinkov.

  • 1. Regulacija ekspresije gena:

    • Poterebno je vedeti ali gre za "hisni" ali za tkivno specificni gen. Vemo, da je regulacija teh dveh skupin genov zelo razlicna. Poleg tega so nekateri tkivno specificni geni regulirani se razvojno in za svojo ekspresijo potrebujejo zelo natancno regulacijo svoje ekspresije, to je pozitivno in negativno regulacijo! Kompleksnejsa regulacija je prisotna tudi pri vseh proteinih, ki so le ena od podenot polipeptida ali holoencima. Poznamo dva razreda regulatornih zaporedij. Cis-delujoci elementi se nahajajo na istem kromosomu. Nekateri delujejo kot promoterji, lezijo 5' glede na gen in vsebujejo zaporedja, ki sodelujejo pri vezavi RNA polimeraze. Drugi delujejo kot enhancerji , zaporedja, ki povecajo uspesno delovanje promoterjev, delujejo v obeh smereh, se nahajajo 3' ali 5' glede na gen in so navadno precej oddaljeni. Trans-delujoci elementi so trans delujoci regulatorni proteini, ki nastajajo na drugih kromosomih in delujejo na obe kopije alelov gena.

    Verjetno bo za uspesno regulacijo prenesenega gena potrebno zagotoviti vse Cis- delujoce elemente medtem, ko bo Trans-delujoce regulatorne proteine zagotovila celica sama. Obseg DNA potrebne za normalno ekspresijo posameznih genov analizirajo na transgenih zivalicah, kjer je tuja DNA vstavljena v genom in je prisotna v razlicnih tkivih. Ugotovljeno je, da je za ekspresijo razvojno reguliranih cloveskih genov za globin * ter globin * potrebnih 5-40 kb 5' glede na genski lokus. Tako velikih kolicin DNA za sedaj ne moremo uspesno vgraditi v nobenega od znanih vektorjev.

  • 2. Prenos in spreminjanje gena:

    • Sam prenos tuje DNA v celice ni tako problematicen, problem je predvsem v tem kaj se potem zgodi z vstavljeno DNA. DNA lahko povsem uspesno prenesemo z fizikalnimi metodami kot so elektroporacija, prenos s pomocjo Ca-fosfata ali pa prenos s pomocjo kationskih lipidov. Problem nastane pri uspesni integraciji prenesene DNA v genom celice, saj se ne vgrajena DNA razgradi v zelo kratekem casu. Retrovirusov se uspesno vgradijo v genom celice. Uporablja se genetsko spremenjene retroviruse, ki ne vsebujejo genov potrebnih za razmnozevanje virusa. Uporabo teh virusov omejujeta velikost DNA, ki jo lahko tak retrovirusni vektor nosi in pa lastnost retrovirusov, da lahko inficirajo le delece celice. Poleg tega je vgraditev v genom nakljucna in zato obstaja nevarnost negativnih stranskih ucinkov, kot je na primer insercijska mutageneza.

    Adenovirusni vektorji lahko nosijo nekaj vec DNA in infecirajo tudi celice, ki se ne delijo. Slaba stran adenovirusov je, da nosijo cel kup svojih genov, ki sprozijo imunski odziv in druge stranske ucinke. Zelo zanimivi vektor je spremenjeni parvovirus imenovan AAV-2. Integrira se specificno v podrocju daljse rocice kromosoma 19.

    Zelo veliko se raziskuje v smeri specificnega ciljanja dolocenih celicnih populacij. Za to potrebujemo specificen protein, ki se veze na dolocene celicne receptorje, na proteinu pa je vezan vektor. Naprimer na azialoglikoprotein vezan polilizin veze specificne receptorje na hepatocitih, ki internilarizirajo glikoproteine, ki se koncujejo z galaktozo. Drug primer je DNA vezana na transferin, ki se veze na celice, ki nosijo transferinske receptorje. Zelo uporabno bi bilo razviti sistem, kjer bi prislo do vnosa direktno v jedro in ne v lizosome. Tak sistem bi lahko izkoriscal tkivno specificne retrovirusnega vektorje ali pa tkivno specificnie promoterje, ki bi jih vseboval vneseni retrovirus.

    Vnos DNA v obliki ekstrakromosomalnih elementov bi bil zanimiv pristop. Taksen element nastane pri fuziji misjih celic in kvasnim umetnim kromosomom (YAC), ki nosi cloveski gen. Na zalost ti elementi slabo segregirajo in se zgubljajo med delitvijo celice. Za boljse razumevanje dela z ekstrakromosomskimi elementi bo potrebno ugotoviti kateri segmenti centromernih in telomernih sekvenc pomagajo pri pravilni segregaciji in obnavljanju kromosomov.

    Gensko terapijo bi lahko izvajali tudi z reaktivacijo sorodnih neaktivnih genov, kot je to primer pri globinskih genih. Napako v *-globinskem genu bi lahko popravili z reaktivacijo *-globinskega gena.

  • 3. Tarcne celice:

    • Pri prvih poizkusih prenosa genov so uporabljali limfocite. Dolocene vrsto T-limfocitov so izolirali iz tumorjev in razrascali in-vitro. Pri tem so jih genetsko spremenili in kasneje ponovno injicirali v telo. Ti limfociti so se vgradili v tumorje in povzrocili odmiranje tumorskih celic. Bolj uporabne bi bile hematopoetske materinske celice. Vecina teh celic ni v fazi delitve in so zato neinfektivne za retrovirusne vektorje. Spodbujanje deljenja teh celic z uporabo hematopoetskih rastnih faktorjev je dalo le omejene rezultate. Nedavno so odkrili posebno vrsto hematopoetskih celic, ki krozijo po krvi in jih razpoznamo po specificnih CD34 antigenih, ki jih nosijo na povrsini. Te celice se naselijo v kosteh, kjer smo pred tem unicili kostni mozeg in se tam razrascajo. V tej fazi jih lahko s pomocjo hematopoetskih rastnih faktorjev transduciramo z retrovirusnimi vektorji.

    Zelo veliko genetskih obolenj je povezanih z jetri. Jetra sestavljajo nedeleci, diferencirani hepatociti, ki so neobcutljivi na infekcijo z retrovirusi. Hepatocite lahko inficiramo z retrovirusi in-vitro in sicer med fazo diferenciacije v zrelo obliko hepatocita. Tako spremenjene hepatocite so injicirali v portalno veno in celice so se naselile v jetrih in tam izrazale preneseni gen. Pri tem je zal potrebno odstaniti del jetrnega tkiva.

    Za gensko terapijo so uporabili tudi keratinocite, ne pa tudi keratinocitskih materinskih celice.

    Prenos genov je mozen tudi v fibroblaste in endotelijske celice zil. Te celice imajo veliko moznosti za uspesno uporabo, ker so razsirjene po celem telesu. Epitelijske celice zracnih poti so zlasti zanimive za gensko terapijo cisticne fibroze. Pri zdravljenju te bolezni so uporabili adenoviruse in dosegli 6 mesecno uspesno ekspresijo CFTR gena.

    Klinicne aplikacije:

  • 1. Monogenske bolezni:

    • Poznamo vec kot 4000 monogenskih bolezni. Dosedanja prizadevanja so usmerjena v terapijo monogenskih recesivnih bolezni, ker patologije dominantnih obolenj se ne razumemo povsem.

    Z vnosom zdravega gena so dosedaj pri ljudeh poizkusali zdraviti cisticno fibrozo, hiperholesterolemijo, pomankanje *1 antitripsina, fenilketonurijo, SCID itd.

  • 2. Rakasta obolenja:

    • Pri zdravljenju rakastih obolenj se uvaja kar nekaj razlicnih strategij:

    *preko povecevanja imunskega odgovora proti tumorjem

    *uvajanje genov v tumorje, ki povzrocajo celicno smrt ter prenos

    *vnos tumor-supresor genov.

    Imunski odgovor lahko stimuliramo preko spreminjanja lastnosti MHC I specificnih citotoksicnih limfocitov T (CD8). CD8 celice potebujejo za aktivacijo peptid vezan na MHC I ter citokine (IL, IF-* in TNF), ki jih izlocajo celice pomagalke. Torej bi lahko v CD8 celice vnesli gene za citokine in tako zagotovili lastno aktivacijo CD8 celic. Celicno smrt lahko povzrocimo z vnosom timidin kinaznega gena herpes simplex virusa (HSV-TK). Celice okuzene z HSV-TK lahko ubijemo z dodatkom zdravil, kot je ganciklovir, ki v fosforilirani obliki vpliva na nepravilno podvojevanje DNA. Na ta nacin bi lahko zdravili tumorje mozgan. Virus injiciran v blizino tumorja, bi se vgradil le v tumorske celice saj so te edine, ki se delijo z razliko od ostalih okoliskih mozganskih celic. Z dodatkom ganciklovira povzrocimo specificno celicno smrt celic, ki so sprejele HSV.

  • 3. Infekcijske bolezni:

    • Zelo veliko raziskav je usmerjenih v zdravljenje AIDS-a. AIDS je pridobljena genetska bolezen, kjer se virusna RNA preko reverzne transkripcije vgradi v genom okuzenih celic. Virus bi radikalno odstranili preko unicenja celotne populacije celic, ki jih virus okuzi, v tem primeru limfocitov T. Drug nacin pa bi bil z selektivnim ugonabljanjem celic, ki nosijo HIV genom preko na primer site- specificne rekombinacije. V tem trenutku nobeden od opisanih pristopov ni dovolj raziskan.

  • 4. Ostale aplikacije genske terapije:

    • Razvija se sisteme za vnos hormonov, faktorjev koagulacije, antikoagulantov ter drugih terapevtskih faktorjev. Mioblasti so zelo primerni, ker spontano postanejo del misicno-vaskularnega tkiva. Produkti vnesenih genov se izlocajo v kri, kjer krozijo in opravljajo svojo vlogo. Pri zdravljenju zivcnih obolenj (Parkinsonova bolezen, Alzheimerjevo obolenje) se raziskuje pristop in-vitro razrascanja transduciranih celic, ki jih kasneje z reimplantacijo vnesejo na specificna mesta.

    Prihodnost genske terapije in eticni problemi:

    O regulaciji ekspresije genov pri sesalcih vemo zelo malo. Prav tako ne vemo dosti o sekvencah DNA, ki bi zagotovile stabilnost vgrajenega segmenta DNA. Ker o slabih posledicah vgrajevanja tuje DNA v genom ne vemo zelo veliko bi bilo morda bolj smotrno razvijati ekstrakromosomalne oblike prenosa genov.

    Zelo velike zaplete pri genski terapiji predstavlja imunski odgovor na terapijo. Pri vecini monogenskih bolezni ne moremo napovedati fenotipsko izrazanje bolezni, kljub prisotnosti identicnih mutacij med osebki in je zato smotrnost genske terapije pri vsakem posamezniku tezko zagovarjati. Spreminjanje zaporedja DNA je za mnoge ljudi apriori odbijajoce. V zadnjem casu se vzpostavlja eticna koda in vsaj za zdaj velja, da somatska genska terapija nima zelo velikega eticnega vprasanja; gre dejansko za neke vrste transplantacijo, kjer implantirani gen spremeni genom posameznega organa in ne celotnega telesa, sprememba pa se ne prenasa na potomce. Spreminjanje spolnih celic je v vecini drzav sedaj prepovedana z zakonom.

    Literatura:

  • 1. British Medical Bulletin vol. 51, 1995. Gene Therapy.
  • 2. Seminars in Oncology: 23(1), Feb 1996.
  • 3. Hospital Practice: 30(11), pp 33-40, Nov 1995.

    • Povzetek je bil pripravljen za WWW 4. novembra 1996. Pripombe in vprasanja glede vsebine zadnjega povzetka posljite Lani (Strmecki@ibmi.mf.uni-lj.si), glede oblikovanja strani pa na naslov: Marko.Dolinar@IJS.SI.

    Nazaj na informacijsko stran DSMB.

    IZRAZANJE GENOV V FETALNEM OBDOBJU

    (Gregor Majdi"c, 11.12.1996)

    Sexual differentiation and normal development of the testis and male genital tract are tightly regulated processes dependent upon a cascade of molecular and morphological events. In the past fifty years the incidence of reproductive problems in males including hypospadias, cryptorchidism and testicular cancer is reported to have increased progressively in many developed countries. Several studies have also presented controversial findings suggesting that the average sperm counts and/or semen quality have also declined over the same time period. It has been suggested that all these problems could arise from events occurring during fetal and/or neonatal life. Male offspring born to mothers who were given diethylstilbestrol (DES), a potent synthetic oestrogen, as a preventive to miscarriage, were found to have increased incidence of undescended testes, urogenital abnormalities and semen abnormalities compared with those from mothers not given DES. Similarities between these observations and the abnormalities being observed in the general population has led to hypothesis that one potential cause of the rise in male reproductive problems might be inappropriate exposure to oestrogens during fetal and/or neonatal life.

    The aims of the present studies were to firstly examine the ontogeny of gene expression during normal development of the fetal rat testis and secondly to investigate if oestrogenic chemicals could affect this process as a first step towards elucidating the mechanisms which might account for the observed problems in male reproductive development.

    In the first part of these studies, temporal and spatial localisation of several different proteins has been examined using immunocytochemistry. Novel results regarding localisation of androgen receptor and inhibin subunits are reported which demonstrate differences in their patterns of expression in fetal and adult Leydig cells. Specifically, in contrast to their adult counterparts, fetal cells do not express androgen receptor suggesting that the negative feedback loop of testosterone on its own production, established in adult testis via the androgen receptor, is not functional in the fetus. Inhibin a and BB subunits were localised to Leydig cells from days 14.5 and 16.5 of gestation respectively. In addition, functional differentiation of fetal Leydig cells has been studied by examining the expression of two steroidogenic enzymes 17a-hydroxylase/17,20-lyase (P450c17) and 3B-hydroxysteroid dehydrogenase (3B-HSD) and two orphan nuclear receptors, steroidogenic factor-1 (SF-1) and DAX-1. As expected 3B-HSD and P450c17 immunolocalised exclusively to fetal Leydig cells. Data on immunoexpression of DAX-1 has not been reported previously; DAX-1 protein was first detectable in the fetal rat testis on day 15.5 in the interstitial cells, simultaneously with the onset of testosterone production. Co-localisation of SF-1 and DAX-1 in the fetal testis demonstrated that both proteins are not exclusively co-localised in the same cell types, a finding at odds with suggestions that SF-1 regulates expression of DAX-1. In the second part, the experiments designed to elucidate potential mechanisms underlying the influence of oestrogens on the developing fetal testis are described. Studies have focused on the expression of the enzyme P450c17 and the transcription factor SF-1. A significant decrease in mRNA expression and enzyme activity of P450c17 occurred in fetuses of mothers treated with DES or the environmental oestrogen octylphenol (OP) but this was not mirrored by an obvious reduction in 3B-HSD immunostaining. The reduction in P450c17 expression was paralleled by a reduction in SF-1 mRNA and protein expression. As SF-1 is known to act to regulate multiple genes in the pituitary - testicular axis, including P450 enzymes, a reduction in expression of this factor could have a significant effect on the development of the testis and genital tract.

    In conclusion, these studies have elucidated the cellular site of expression of several gene products implicated in fetal testicular development and demonstrated that in some cases gene expression is reduced in fetuses from oestrogen-treated mothers.

    Povzetek je bil pripravljen za WWW 10. decembra 1996. Pripombe in vprasanja glede vsebine zadnjega povzetka posljite Gregorju (MajdicGr@vf.uni-lj.si), glede oblikovanja strani pa na naslov: Marko.Dolinar@IJS.SI.

    Nazaj na informacijsko stran DSMB.